产品概述
本品是利用M-MLV反转录酶的反转录试剂盒，cDNA产物可直接用于qPCR检测。qRT SuperMix中包含反转录反应所需的所有组分，并针对Oligo dT(18T) Primer、 Random 6 mers Primer用量进行了优化，使反转录产物兼容染料嵌合法和探针法qPCR检测，能够进行高效的基因表达分析。在进行下游定量PCR实验中，Total RNA中混入的基因组 DNA（gDNA）可直接作为反应的模板进行扩增，可能会造成实验结果的假阳性。本品中gDNA Eraser Mix可有效去除残留的基因组DNA，确保定量结果的准确性，本品中配有NRT Control Mix，可用于配制无反转录酶的阴性对照反应。
产品组成
试剂盒组成 | FZ019-10 | FZ019-100 |
gDNA Eraser Mix*1 | 24 μL *1 | 240 μL *1 |
5X qRT SuperMix*2 | 40 μL*1 | 400 μL*1 |
NRT Control Mix *3 | 8 μL*1 | 80 μL*1 |
RNase free water | 1 mL*1 | 1 mL*2 |
*1：gDNA Eraser Mix可搭配 5X qRT SuperMix或NRT Control Mix 使用。
*2：该溶液含有Evo M-MLV RTase、RNase Inhibitor、dNTPs、Oligo dT (18T) Primer与Random 6 mers Primer
*3：该溶液不含Evo M-MLV RTase， 其余组分与 5X qRT SuperMix完全相同
储存及运输条件
冰袋运输。试剂置于-20 ℃保存，有效期18个月。
操作方法
1. 去基因组DNA与反转录反应
本产品有两种使用方法，可根据需求进行选择。操作如下：
l 方法一： All in one（去除gDNA与反转录反应同时进行）
当RNA质量较高（gDNA残留少），或反应中RNA浓度较高、目标基因拷贝数较高时，可将去除gDNA与反转录合为一步操作。
按照下表配制反应液*1、 *2，同时进行基因组DNA去除与反转录反应。
组分名称 | 20μL体系 |
gDNA Eraser Mix | 2 μL |
5X qRT SuperMix | 4 μL |
Total RNA*3 | - |
RNase free water | up to 20 μL |
反应条件
步骤 | 温度 | 时间 |
1 | 37 ℃ | 15 min |
2 | 85 ℃ | 5 sec |
3 | 4 ℃ | Hold*4 |
*1：反应体系可以根据需要进行调整，各组分按比例变更即可
*2：配制试剂时，建议加样顺序按照RNase free water、gDNA Eraser Mix、 5X qRT SuperMix依次添加，配制完成后用移液器轻柔吸打混匀，混匀后加入 RNA 模板。NRT Control 是指无反转录酶的阴性对照反应，可根据实际需要进行配制。配制时，将5X qRT SuperMix替换成 NRT Control Mix 即可
*3：Total RNA 可根据需要添加，提取的 RNA 建议使用 RNase free water 进行溶解。在20μl 反转录体系中，使用 SYBR 法进行qPCR扩增时，建议Total RNA加入量不超过 1μg；使用探针法进行qPCR扩增时，建议Total RNA加入量不超过 2μg。
*4：反应产物如立即用于后续 qPCR 反应，可暂放于 4℃或冰上；如短期保存建议放置于-20℃；如长期保存建议放置于-80 ℃。
l 方法二：两步法（先去除gDNA，再进行反转录）
1.1 去除gDNA
按照下表配制反应液*1、*2，进行基因组DNA去除反应。
组分名称 | 20μL体系 |
gDNA Eraser Mix | 2 μL |
Total RNA*3 | - |
RNase free water | up to 16 μL |
反应条件
步骤 | 温度 | 时间 |
1 | 42 ℃ | 2 min |
2 | 4 ℃ | Hold*4 |
*1：反应体系可以根据需要进行调整，各组分按比例变更即可
*2：配制试剂时，建议先将gDNA Eraser Mix与RNase free water配制成预混液，用移液器轻柔吸打混匀后，再加入RNA模板。
*3：Total RNA可根据需要添加，提取的RNA建议使用RNase free water进行溶解。在20μl 反
转录体系中，使用SYBR法进行qPCR扩增时，建议Total RNA加入量不超过1μg；使用探针法进行qPCR扩增时，建议Total RNA加入量不超过2μg。
*4：反应产物取出后置于冰上，立即进行后续反转录反应
1.1 反转录反应
配制反转录反应液*1，置于 PCR 仪进行反转录反应。
组分名称 | 20μL体系 |
步骤1. 去除gDNA反应液 | 16 μL |
5X qRT SuperMix*2 | 4 μL |
Total | 20 μL |
反应条件
步骤 | 温度 | 时间 |
1 | 37 ℃ | 15 min*2 |
2 | 85 ℃ | 5 sec*3 |
3 | 4 ℃ | Hold |
*1：反应体系可以根据需要进行调整，各组分按比例变更即可。
*2：NRT Control 是指无反转录酶的阴性对照反应，可根据实际需要进行配制。 配制时，将5X qRT SuperMix替换成 NRT Control Mix 即可
*3：若反应产物立即用于后续 qPCR反应，可暂放于4℃或冰上；如短期保存建议放置于-20℃，如需长期保存建议放置于-80℃。
2. 定量 PCR 分析
经上述反转录过程得到的 cDNA 可以直接进行定量 PCR 分析。推荐搭配本公司产品 SYBR Green qPCR premix试剂盒使用。
