产品概述
本制品是利用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR的试剂盒，是一种2X premix型试剂，反应液配制十分简，仅需加入引物、模板及RNase free water即可。本制品对SYBR Green I浓度、PCR反应体系都进行了优化，采用了反应性能优越的Pro Taq HS DNA polymerase 体系，能够有效抑制非特异性产物的扩增，提高PCR扩增效率，可以进行高灵敏度的Real Time PCR反应，在宽广的测量区域内得到良好的标准曲线，从而对靶基因进行准确定、检测。
产品组成
试剂盒组成 | FZ020-100 | FZ020-500 |
2X SYBR Green qPCR Premix*1 | 1mL*1 | 1mL*5 |
ROX Reference Dye (4 μM) | 40μL*1 | 200μL*1 |
ROX Reference Dye (20 μM) | 40μL*1 | 200μL*1 |
*1：溶液在 -20℃ 存放时可能会产生白色或淡黄色的沉淀，使用前可于冰上溶解或手握溶解，颠倒混匀至沉淀全部消失。请勿涡旋振荡。
储存及运输条件
冰袋运输。避光保存在-20℃; 产品可于4℃，保存6个月。
操作方法
（以ABI QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR Systems为例）
1. 配制RT-qPCR反应液
组分名称 | 20μL体系 |
2X SYBR Green qPCR Premix*1 | 10 μL |
Primer F (10μM) | 0.5 μL*2 |
Primer R (10μM) | 0.5 μL *2 |
ROX Reference Dye (4 μM) *3 | 0.4 μL |
Template *4 | ≤ 100 ng |
RNase free water | up to 20 μL |
*1：产品避免反复冻融，防止酶活降低；使用前可上下颠倒混匀， 请勿涡旋振荡混匀；产品中含有 SYBR Green，操作过程中注意避光。
*2：引物推荐使用终浓度为0.25 μM，也可以根据需要在0.2～1.0 μM范围内调整。
*3：若需要使用ROX进行荧光信号校准，请按照仪器推荐量添加；若不需要，可使用RNase free water代替ROX Reference Dye加入反应体系。
*4：在 20 μl 体系里， DNA 模板添加量通常在 100 ng 以下，必要时可以进行梯度稀释，以确定合适的模板添加量；如果使用本制品进行 cDNA 的定量PCR 扩增， cDNA 原液使用体积不要超过定量 PCR 反应总体积的 10%。
2. 设置qPCR反应程序*1
推荐选择两步法扩增程序*2，具体如下表所示：
qPCR反应程序（两步法） | |||
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
1 | 95 ℃ | 30 sec*3 | 1 |
2 | 95 ℃ | 5 sec | 40 |
60 ℃ | 30 sec*4 | ||
3 | 熔解曲线 | ||
产品应用实例
2、不同模板量重复性
低丰度基因检测：选用HepG2细胞的总RNA检测HSD17B13基因，逆转录模板约为1 μg，qPCR模板（折算总RNA量）100 ng和10 ng时，重复性良好
