概述

          单核-巨噬系统（Mononuclear Phagocyte System，MPS），是由一组具有共同起源、形态和功能的细胞组成的系统。这些细胞主要负责吞噬和消化体内的病原体、死细胞和异物，参与免疫防御和组织修复。近年来，随着对单核巨噬细胞的深入研究，发现巨噬细胞与多种疾病有关，包括代谢、自身免疫、癌症等疾病均具有重要调控作用，因此，针对单核巨噬细胞的靶向递送对于相关领域的药物开发、疾病机制研究至关重要。mRNA in vitro，帮助单核巨噬细胞研究进入新的周期，实现敲低和过表达，为单核巨噬细胞靶点验证提供保障。为解决更多单核巨噬细胞靶点的体内概念验证和成药研究，多纳医药基于自有知识产权的核酸递送技术，开发了用于体内单核巨噬细胞递送的CALNP™ MPS-LNP制剂服务，为更多单核巨噬细胞研究的体内验证提供支持和保障。

研发流程

1、靶点调研

2、体外序列筛选

3、最优序列合成

4、CALNP™ MPS-LNP制备

5、动物模型验证

已验证数据

1、CALNP™ MPS-LNP制剂理化性质

2、体外巨噬细胞CALNP™ MPS-LNP转染效率研究

选用RAW264.7、J774和MH-S三种小鼠巨噬细胞计数种板，贴壁培养过夜，换液加入含有不同浓度的CALNP™ MPS-LNP（包裹X-siRNA，X为巨噬细胞特异性表达蛋白）转染24 h后检测细胞X-mRNA水平，结果显示高、低浓度CALNP™ MPS-LNP孵育均可显著敲低三种巨噬细胞敲低X-mRNA水平，其中高浓度组减少约80% mRNA表达。

图1. 三种巨噬细胞体外孵育CALNP™ MPS-LNP敲低巨噬细胞相关基因mRNA水平。

3、体内系统给药递送CALNP™ MPS-LNP制剂——连续两次给药（PK-PD研究）

C57BL/6J小鼠腋下接种5×10⁵个CT26细胞，待肿瘤体积增长至300~500 mm³，给予小鼠包载Cy5-siRNA的CALNP™ MP-LNP制剂，隔天给药一次，剂量为1 mg/kg。两次给药后，在6小时、24小时和48小时的时间点对小鼠离体脏器进行荧光强度测定，发现除心脏以外，其他脏器在注射后的6小时均显示出强烈的Cy5荧光信号，并在此时达到最高值。特别地，在肝脏、脾脏和肿瘤组织中，Cy5荧光信号的持续时间较长，至24小时甚至48小时后仍可检测到。

图2. CT26荷瘤小鼠连续两次给予Cy5-siRNA-CALNP™ MPS-LNP后不同时间点离体脏器荧光强度。

对荧光分布较多的肝、脾和肿瘤组织，进行消化后，测定不同时间点CD11b+/CD45+细胞内Cy5荧光强度与F4/80的关系。可见Cy5阳性细胞主要为F4/80阳性的巨噬细胞，在肝和脾中分别于1h和6h有最大Cy5阳性细胞比例，对于肿瘤，在6h、24h和48h均有明显Cy5阳性巨噬细胞的积累。与离体组织荧光成像结果一致。

图3. CT26荷瘤小鼠连续两次给予Cy 5-siRNA-CALNP™ MPS-LNP后不同时间点肿瘤组织内巨噬细胞Cy5荧光强度变化。

图5. CT26荷瘤小鼠连续两次给予Cy 5-siRNA-CALNP™ MPS-LNP后不同时间点脾脏组织内巨噬细胞Cy5荧光强度变化。

离体组织裂解后进行RNA提取和RT-qPCR检测，结果显示脾脏、肝脏和肿瘤组织中给药后6 h和24 h可敲低目标基因50%~80%，其中6 h敲低效果最明显。

图6. CT26荷瘤小鼠连续两次给予Cy 5-siRNA-CALNP™ MPS-LNP后不同时间点各脏器组织内敲低基因mRNA水平变化。

 4、体内系统给药递送CALNP™ MPS-LNP制剂——连续多次给药（Efficacy研究）

C57BL/6J小鼠腋下接种5×10⁵个CT26细胞，待肿瘤体积增长至~150 mm³，给予小鼠包载X-siRNA的CALNP™ MP-LNP制剂，隔天给药一次，剂量为1 mg/kg。从肿瘤生长曲线可见，从第四次给药开始，给与siRNA药物组相比较与对照组肿瘤生长显著被抑制并持续到末次给药，两组动物体重均正常增加，实验给药过程中无动物死亡。

图7.MC38荷瘤小鼠多次给予siRNA-CALNP™ MPS-LNP（治疗性）后肿瘤生长曲线和体重增长曲线。

实验终点分离脏器组织进行消化提取RNA后采用RT-qPCR方法检测不同脏期内目标敲低基因mRNA表达水平，结果显示脾脏、肝脏和肿瘤组织中给药组相较于对照组目标基因敲低明显，其中脾脏表达抑制最多，约65%；肝脏和肿瘤组织中RNA表达抑制约为30%。

图8. MC38荷瘤小鼠多次给予siRNA-CALNP™ MPS-LNP（治疗性）后终点不同组织敲除基因mRNA水平测定。

同时，在实验终点也收集了动物血浆进行血生化和血细胞计数分析，结果显示两组间各个指标均无显著差异，结合给药期间动物体重的正常增加显示siRNA-CALNP™ MPS-LNP制剂安全性良好，动物均可耐受。